ELISA标准曲线样品检测关键注意事项

　　一、标准品处理与稀释

　　溶解与分装?

　　冻干标准品需按说明书要求精确复溶，冰上操作并静置5-10分钟，轻柔混匀后分装保存于-20℃或-70℃，避免反复冻融?。

　　稀释时使用硅化EP管减少蛋白吸附，梯度稀释需充分混匀，避免枪头刮划孔底?。

　　稀释方法?

　　推荐反向稀释法(从高浓度向低浓度逐级稀释)，确保梯度准确性?。

　　标准品工作液现配现用，避免长时间室温放置导致降解?。

　　二、实验操作规范

　　加样与孵育?

　　使用多通道移液器或校准单通道移液器，确保加样体积一致，避免孔间污染?。

　　孵育时覆盖板盖，保持37℃恒温(温差≤1℃)，避免边缘效应?。

　　洗涤控制?

　　洗涤液注满孔内但不溢出，手工洗板时甩板动作需迅速(旋转120-150度)，避免交叉污染?。

　　洗板后拍干使用无尘滤纸，避免残留液体或碎屑干扰结果?。

　　三、显色与检测

　　显色反应?

　　显色时间控制在15-30分钟，标准品前4孔应呈现明显蓝色梯度，最大OD值≥1.2?。

　　终止反应后15分钟内完成比色，避免显色产物降解?。

　　仪器校准?

　　酶标仪预热30分钟，使用标准滤光片校准波长(如TMB底物选450nm)?。

　　双波长检测(如450nm/630nm)可减少背景干扰?。

　　四、数据验证与异常处理

　　标准曲线有效性?

　　线性回归R2≥0.99，低浓度区间需符合预期梯度?。

　　若曲线整体偏低(最大OD<1.2)，需检查试剂活性或标准品溶解状态?。

　　常见问题解决?

　　无信号?：排查试剂失效(如HRP酶污染)或操作遗漏(如漏加抗体)?。

　　高背景?：优化封闭条件(延长封闭时间或更换封闭剂)或增加洗涤次数?。

　　五、质量控制建议

　　每批次实验设置复孔(CV%<15%)，边缘孔弃用或单独分析?。

　　定期校准移液器和酶标仪，避免设备误差?。

　　注：仅供科研使用，以上资料供参考，如需具体产品说明请咨询技术老师或品牌供应商。

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